تعيين سطح حساسيت لاروي نسبت به دوزهاي تمايزي لاروكش ها
عباس پودات مربی دانشکده بهداشت و کارشناس ارشد حشره شناسی پزشکی
www.malaria.coo.ir ، www.malaria.blogfa.com
1- اهداف :
1- تعیین سطح حساسیت و مقاومت لارو نسبت به مواد لاروکش
2- تعیین غلظت مورد نیاز جهت یک محلول لاروکش
3- تعیین دوز کشنده استاندارد
2- وسايل و مواد لازم جهت انجام تست حساسيت لاروها :
- بشر 50 و 500 ميلي ليتري هر کدام 4 عدد
- پي پت 1 ميلي ليتري
- قطره چكان يا توري
- دماسنج آب
- دماسنج هوا
- كووت
- محلولهاي استوك لاروكش استاندارد WHO
3- روش تهيه غلظت مورد نياز از دوزهاي تمايزي جهت انجام تست حساسيت لاروي :
براي تهيه غلظت مورد نياز از غلظت هاي استوک ذكر شده به شرح زير عمل مي نمائيم. با افزودن 1 ميلي ليتر از اين محلول ها به 249 ميلي ليتر آب غلظت نهايي آن به ترتيب، به ميزان، مالاتيون1 125/3 ميلي گرم در ليتر، تمفوس2 625/0 ميلي گرم در ليتر، فنيتروتيون3 125/0 در ليتر و كلرو پيريفوس4 025/0 ميلي گرم در ليتر بدست مي آيد. محلول شاهد با افزودن 2 درصد بوتانول به اتانول خالص تهيه شده و براي كاربرد 1 ميلي ليتر از اين محلول را به 249 ميلي ليتر آب در بشر اضافه می نمائیم.
1- Malathion
2- Temephos
3- Fenitrothion
4- Chlorpyrifos-ethyl
4- طريقه انجام تست حساسيت لاروي:
تست حساسيت به روش استاندارد WHOانجام می شود. ابتدا در تكرارهاي مورد آزمايش، در هر بشر 50 میلی لیتری 25 ميلي ليتر آب ریخته و تعداد 25-20 عدد لارو آخر سن 3 و ابتداي سن 4 را در آن قرار می دهیم. يك ساعت آنها را استراحت داده و در صورت وجود لارو ضعيف يا مرده آنها را از تست خارج مي کنيم. در مورد لاروهاي صيد شده از فيلد، ابتدا آنها را در كووت ريخته و براي مدتي در حدود 2-5/1 ساعت به آنها استراحت داده مي دهیم تا استرس ناشي از حمل و نقل و ضربه در آنها از بين برود، سپس لاروهاي سنين مختلف را باید جدا سازي و به انسكتاريوم منتقل کنیم. براي هر دوز تمايزي 4 تكرار و براي شاهد 2 تكرار در نظر گرفته مي شود. براي جلوگيري از اشتباه باید روي بشرها اتيكت نصب گردد.
در مرحله بعد در هر يك از بشرها ی 500 میلی لیتری 224 ميلي ليتر آب تميز ( آشاميدني فاقد كلر یا آب ژیت لاروی) اضافه نموده و سپس بوسيله پي پت هاي پوار دار بطور جداگانه به مقدار 1 ميلي ليتر از هر لاروكش را برداشته و به بشرهاي 224 ميلي ليتري اضافه مي کنیم و محلول را خوب هم زده تا سم بطور یکنواخت در آن مخلوط شود، در اينجا غلظت مورد نظر از هر لاروكش بدست مي آمد. در مرحله بعد با دقت و به آهستگی بشرهاي 25 ميلي ليتري محتوي لارو به هر يك از بشرهاي 224 ميلي ليتري محتوي سم اضافه مي کنیم. ( در کل 249 میلی لیتر آب و 1 میلی لیتر سم داریم ).
پس از آن زمان و درجه حرارت را ثبت نموده و آنها را به انسكتاريوم منتقل كرده و 24 ساعت تحت نظر قرار می دهیم و بعد از طي دوره Recovery period نتايج مرگ و مير در فرمهایي که بدین منظور تهیه گردیده ثبت مي کنیم.
در موارد زیر تست انجام شده غیر قابل قبول بوده و می بایست تکرار گردد:
1. اگر بيشتر از 10 درصد لاروهاي بشر كنترل در حين آزمايش به پوپ تبديل شوند، آزمايش تكرار ميبایست تکرار شود.
2. در صورتی که مرگ و مير شاهد بيش از 20 درصد باشد.
5- نکات مهم :
· دماي مناسب براي تست حساسيت لارو بايد بين 30-20 درجه سانتي گراد باشد.
· براي ثبت درجه حرارت آب بشرهاي مختلف بايد دماسنج را با استن شستشو دهيم.
· پس از برداشت محلول لاروكش بايد بلافاصله درب ظرف محتوي لاروكش را ببنديم. زيرا در اثر تبخير حلال كه الكل مي باشد، غلظت لاروكش موجود در ظرف تغيير مي كند.
· پس از انجام تست بايد ظروف مورد استفاده را به دقت با آب و مواد پاك كننده شستشو داد.
· مرگ و مير شاهد اگر كمتر از 5 درصد باشد تست صحيح است. در صورتيكه مرگ و مير شاهد بين 20- 5 درصد باشد با استفاده از فرمول ابوت (Abbot) باید تصحيح گردد
% مرگ و مير شاهد - % مرگ و مير تست
100 × ----------------------------- = فرمول ابوت ( Abbot )
% مرگ و مير شاهد - 100
دما، رطوبت، تراكم و تغذيه، عواملي هستند كه با تغيير اينها افزايش يا كاهش در ميزان حساسيت نمونه هاي آزمايشگاهي ديده مي شود، درنتيجه بايد در اين رابطه دقت نمود و شرايط يكسان پرورش اعمال مي گرديد.